掌握细菌培养：全球生长与分析指南

细菌培养是现代微生物学的基石，支撑着医学、农业、环境科学和工业生物技术的进步。无论您是刚开始学习微生物学课程的学生，还是在全球实验室工作的经验丰富的研究员，理解细菌培养的原理和实践都至关重要。本综合指南从全球视角出发，提供了从精细的培养基制备到复杂的分析方法等基本技术，旨在为世界各地的科学家赋能。

细菌生长的基础知识

作为单细胞微生物，细菌需要特定的条件才能生长和繁殖。理解这些需求是成功进行细菌培养的第一步。影响细菌生长的关键因素包括：

营养物质

细菌需要能量来源和构建细胞成分的基石。培养基旨在提供这些必需的营养物质，其中可包括：

• 碳源：糖类（如葡萄糖、乳糖）、氨基酸和有机酸。
• 氮源：氨基酸、肽和无机盐。
• 维生素和生长因子：少量需要的有机化合物。
• 矿物质：磷酸盐、硫酸盐、镁和铁等离子。

温度

每种细菌都有其最佳的生长温度范围。维持正确的孵育温度至关重要。广义上，细菌可以根据其温度偏好进行分类：

• 嗜冷菌 (Psychrophiles)：在低温（0-20°C）下生长最佳。
• 嗜中温菌 (Mesophiles)：在中等温度（20-45°C）下生长最佳，其中包括大多数致病菌。
• 嗜热菌 (Thermophiles)：在高温（45-80°C）下生长最佳。
• 超嗜热菌 (Hyperthermophiles)：在极高温度（>80°C）下生长最佳。

对于全球实验室而言，考虑到地区差异，了解环境温度并确保孵育箱的可靠温度控制至关重要。

pH值

环境的酸碱度显著影响细菌的酶活性和细胞膜完整性。大多数细菌偏好中性pH值（约6.5-7.5）。在极端pH条件下生长的生物被称为：

• 嗜酸菌 (Acidophiles)：偏好酸性环境（pH < 5.5）。
• 嗜中性菌 (Neutrophiles)：偏好中性环境（pH 5.5-8.0）。
• 嗜碱菌 (Alkaliphiles)：偏好碱性环境（pH > 8.0）。

氧气供应

不同细菌对氧气的需求差异很大：

• 专性需氧菌 (Obligate aerobes)：需要氧气进行呼吸。
• 专性厌氧菌 (Obligate anaerobes)：不能耐受氧气，氧气对其有毒。
• 兼性厌氧菌 (Facultative anaerobes)：在有氧或无氧条件下都能生长，但有氧时优先利用氧气。
• 耐氧厌氧菌 (Aerotolerant anaerobes)：在有氧或无氧条件下都能生长，但不利用氧气进行呼吸。
• 微需氧菌 (Microaerophiles)：需要氧气，但其浓度低于大气中的浓度。

正确地创造厌氧或微需氧条件对于培养特定的细菌群体至关重要。

水分

水是所有微生物生命所必需的。培养基通常提供足够的水分，而维持孵育箱内的湿度对于某些培养物可能很重要。

培养基的类型

培养基是细菌培养的命脉。它们的配方旨在支持特定类型细菌的生长或观察特定的代谢活动。培养基可以通过多种方式进行分类：

按成分分类

• 确定成分培养基（合成培养基）：所有化学成分及其浓度都是已知的。这允许对生长环境进行精确控制，非常适合研究特定的代谢途径。
• 复合培养基（非确定成分培养基）：含有成分未知的配料，如酵母提取物、蛋白胨或牛肉提取物。这些培养基营养丰富，支持多种细菌的生长，使其成为通用培养的多功能选择。

按物理状态分类

• 液体培养基（肉汤）：用于培养大量细菌、检查运动性或进行生化测试。
• 固体培养基：液体培养基中加入固化剂，通常是琼脂。琼脂是一种从海藻中提取的多糖，即使在高温下也能保持固体状态，从而可以分离单个菌落。
• 半固体培养基：含有较低浓度的琼脂，用于观察细菌的运动性。

按用途分类

• 通用培养基：支持多种非苛养菌的生长（例如，营养肉汤、胰蛋白酶大豆肉汤）。
• 富集培养基：有利于某一特定细菌群体生长，同时抑制其他细菌的液体培养基。常用于从混合菌群中分离病原体（例如，用于沙门氏菌的亚硒酸盐肉汤）。
• 选择性培养基：含有抑制剂的固体培养基，可抑制不需要的细菌生长，从而使所需微生物得以繁殖。例如麦康凯琼脂（抑制革兰氏阳性菌，选择革兰氏阴性菌）和甘露醇盐琼脂（抑制除葡萄球菌外的大多数细菌）。
• 鉴别培养基：能够根据细菌的代谢活动在视觉上区分不同细菌的固体培养基。它们含有指示剂，会因特定的生化反应而变色（例如，麦康凯琼脂可区分乳糖发酵菌和非发酵菌；血琼脂可根据溶血性区分细菌）。
• 运送培养基：用于在从采集地到实验室的运输过程中维持细菌的活力，而不促进其生长。

核心实验室技术

掌握这些技术对于获得可靠结果和防止污染至关重要：

无菌技术

无菌技术是防止有害微生物污染的做法。这在任何微生物实验室中都是基础，无论其地理位置或资源如何。关键要素包括：

• 灭菌：消除设备和培养基中的所有微生物生命。常用方法包括高压灭菌（蒸汽灭菌）、干热灭菌、过滤和化学灭菌。
• 个人防护装备（PPE）：穿戴实验服、手套和护目镜。
• 在火焰旁操作：使用本生灯或酒精灯产生向上的气流，防止空气中的污染物落在培养基上。
• 灼烧接种环和接种针：在转移细菌前后对接種工具进行灭菌。
• 对培养容器口进行灭菌：在取样前后灼烧试管和烧瓶的开口。

在多样化的全球环境中，确保获得无菌一次性用品或可靠的灭菌设备是一个重要的考虑因素。

接种

接种是将细菌样本（接种物）引入培养基的过程。常见的接种方法包括：

• 划线接种法：用于在固体培养基表面获得分离的菌落。这涉及将少量接种物以特定模式在琼脂平板上划开，从而逐步稀释细菌。一种常用方法是四区划线法。
• 倾注平皿法：将接种物与熔化（但已冷却）的琼脂培养基混合，然后倒入培养皿中。此方法可用于计数活菌（菌落形成单位，CFUs）。
• 涂布平皿法：使用无菌涂布棒将接种物均匀地涂布在凝固的琼脂表面。此方法也用于计数和获得分离的菌落。
• 肉汤接种：使用无菌接种环或移液管将少量接种物转移到液体培养基中。

孵育

孵育是将接种好的培养基在特定温度下放置特定时间，以允许细菌生长的过程。孵育的关键因素包括：

• 温度：如前所述，使孵育箱温度与目标细菌的最佳生长温度相匹配。
• 时间：对于快速生长的细菌，孵育期可能为18-24小时；对于生长缓慢的细菌或某些特殊培养物，则可能需要数天或数周。
• 气体环境：如果需要，提供正确的气体环境（需氧、厌氧、微需氧）。厌氧罐或厌氧工作站用于培养厌氧菌。

可靠、经过校准的孵育箱至关重要。在电力供应不稳定的地区，可能需要备用发电机或其他孵育方法。

细菌培养物的分离与纯化

通常，目标是获得由单一细菌物种组成的纯培养物。这通常通过系列稀释和接种技术实现：

获得分离菌落

在合适的固体培养基上进行划线接种是分离单个细菌菌落的主要方法。菌落是一团可见的细菌，理论上源于单个细胞或一小群细胞（一个菌落形成单位或CFU）。

转种

一旦获得分离的菌落，就可以将它们转种到新鲜的培养基中以获得更大的纯培养物。这涉及使用无菌接种工具将分离菌落上的少量生长物转移到新平板或肉汤中。

纯度检查

通过对转种后的培养物进行划线接种来检查其纯度。如果新平板上只出现一种形态的菌落，则该培养物很可能是纯的。显微镜检查也可以确认细胞形态和排列。

常见挑战与故障排除

与许多科学研究一样，细菌培养也可能面临挑战。解决这些问题需要系统性的故障排除：

污染

最常见的问题。来源包括：

• 无菌技术操作不当。
• 培养基或设备未灭菌。
• 实验室内空气污染。
• 灭菌设备故障。

解决方案：严格遵守无菌技术，定期校准和维护灭菌设备，使用经过认证的无菌耗材，以及保持适当的通风。

不生长或生长不良

可能的原因：

• 孵育温度不正确。
• 培养基配方不当（缺乏必需营养素，pH值不正确）。
• 接种物不足。
• 培养基有毒性。
• 存在抑制物质。
• 接种物在孵育前已死亡。

解决方案：核实孵育箱温度，审查培养基成分和制备方案，确保接种物的活力（例如，通过在通用培养基上进行测试），并查阅文献以了解特定生长要求。

生长缓慢

可能是由于条件不理想或物种生长缓慢所致。

• 解决方案：延长孵育时间，确保最佳温度和pH值，使用富集培养基，并尽量减少对培养物的干扰。

错误鉴定

如果分离或纯度检查不足，可能会发生这种情况。

• 解决方案：采用多次分离步骤，使用选择性和鉴别培养基，并通过生化测试或分子方法进行确认。

先进技术与应用

除了基本的培养技术，全球范围内还采用了几种先进技术：

细菌定量

确定样品中活菌数量对于许多应用至关重要：

• 平板计数（CFU/mL）：系列稀释后进行接种并计数菌落。需要精确的稀释和在最佳条件下孵育。
• 最大可能数法（MPN）：一种用于估计细菌数量的统计方法，尤其适用于水或食品样品中稀释困难或细菌数量较低的情况。它涉及用不同体积的样品接种多管液体培养基并观察生长情况。
• 直接显微镜计数：使用校准过的载玻片（如Petroff-Hausser计数室）在显微镜下直接计数细菌。这种方法计算活细胞和死细胞。
• 比浊法：使用分光光度计测量液体培养物的浊度。光密度（OD）与细菌浓度成正比，但也包括死细胞。

生化测试

一旦细菌被分离纯化，就使用生化测试根据其代谢能力来区分它们。这些测试通常在试管中或琼脂平板上进行，可包括：

• 过氧化氢酶测试
• 氧化酶测试
• 糖发酵（如乳糖、葡萄糖）
• 吲哚产生
• 柠檬酸盐利用
• 脲酶产生

全球许多诊断实验室都使用标准化的生化测试套件进行快速鉴定。

分子鉴定

随着基因组学的发展，分子方法越来越多地用于细菌鉴定和表征：

• 16S rRNA基因测序：一种广泛用于细菌系统发育鉴定的方法。
• PCR（聚合酶链式反应）：用于检测特定基因、抗生素抗性标记或鉴定病原体。
• 全基因组测序（WGS）：为菌株分型、毒力因子分析和理解进化关系提供全面的遗传信息。

与传统的基于培养的鉴定方法相比，这些方法具有更高的特异性和速度，尤其对于苛养菌或生长缓慢的微生物。

细菌培养的全球考量

在全球背景下工作时，有几个因素需要特别注意：

资源可用性

世界各地的实验室在不同资源水平下运作。虽然先进设备是理想的，但通过基础材料和严格遵守基本原则通常也可以成功进行培养。例如，根据当地可用成分调整培养基配方而不影响质量是一种常见的做法。

环境因素

环境温度和湿度会显著影响孵育。在热带地区，控制孵育箱温度变得更具挑战性。在干旱地区，维持琼脂平板的水分可能是一个问题。

法规标准

不同国家和行业对微生物检测有特定的法规和指南（例如，在食品安全、制药和临床诊断领域）。熟悉这些标准至关重要。

培训与专业知识

确保全球团队的一致培训并保持高水平的技术专长对于获得标准化的结果至关重要。

结论

细菌培养仍然是微生物学中不可或缺的工具。通过掌握细菌生长的基本原理，理解培养基选择和制备的细微差别，采用严格的无菌技术，并运用适当的孵育和分析方法，全球各地的科学家可以有效地培养和研究细菌。挑战虽多，但通过周密的计划、细致的执行以及对持续学习的承诺，成功的细菌培养对于任何实验室来说都是一个可以实现的目标，为全球关键的研究和诊断做出贡献。